Hiện nay, kỹ thuật ELISA được xem có độ nhay cao trong chẩn đoán các bệnh ký sinh trùng đường ruột. Tuy nhiên trong quá trình thực hiện cũng có thể xảy ra rất nhiều vấn đề như những gì xảy ra ở hầu hết các xét nghiệm miễn dịch. Bài viết sẽ cung cấp cách xử lý một số sự cố thường gặp trong quá trình thực hiện thí nghiệm.
1. Trường hợp độ đọc của mẫu nằm ngoài phạm vi giới hạn
Nguyên nhân | Cách khắc phục |
Mẫu không chứa hoặc chứa lượng chất cần phát hiện | Nếu lượng mẫu ít dưới mức phát hiện thì có thể tăng lượng mẫu |
Mẫu chứa nồng độ chất cần phát hiện cao hơn ngưỡng tiêu chuẩn | Cần pha loãng mẫu và mẫu cần được phân tích lại |
2. Trường hợp phản ứng không lên màu
Đôi khi không có sự phát màu (không có tín hiệu) trong phản ứng ELISA, đa số các trường hợp này là do bất cẩn. Khi đó chỉ cần kiểm tra hoặc xem xét lại từng bước để khắc phục các sự cố không cần thiết
Nguyên nhân | Cách khắc phục |
Thuốc thử bị sử dụng sai thứ tự hoặc một bước thí nghiệm nào đó đã bị bỏ qua | Kiểm tra lại các bước trong quy trình và lặp lại thí nghiệm |
Sử dụng không đúng chất cộng hợp (Conjugated) | + Mỗi chất cộng hợp là đặc hiệu cho mỗi bộ kit do đó cần phải sử dụng đúng loại + Không chuẩn bị các dung dịch quá xa thời điểm làm thí nghiệm + Nếu dung dịch cộng hợp cần phải pha loãng thì phải lấy đủ dùng và sử dụng ngay. Không sử dụng lại phần thừa cho ngày hôm sau |
Thiếu bổ sung cơ chất (Substrate) | Bổ sung cơ chất và tiếp tục thí nghiệm |
Không đủ kháng thể hoặc không phát hiện được | Bổ sung thêm kháng thể và tiếp tục thí nghiệm |
3. Tín hiệu nền cao
Tín hiệu nền cao trong phản ứng ELISA thường biểu hiện ở sự hiện màu quá mức hoặc chỉ số OD cao. Tuy nhiên trong một số trường hợp sự hiện màu và độ đọc OD không cao. Vấn đề này có thể là do không chú ý trong quá trình rửa dẫn đến một số lỗi
Nguyên nhân | Cách khắc phục |
Dùng nước không đảm bảo trong quá trình pha dung dịch rửa hay sử dụng để rửa mẫu | Dùng nước cất để pha dung dịch rửa hoặc để rửa giếng |
Rửa không đúng khuyến cáo của nhà sản xuất | + Cố gắng sử dụng số lần rửa cao nhất được khuyến cáo cho thí nghiệm + Nếu sử dụng máy rửa thì đảm bảo ít nhất 400 µl dung dịch rửa có trong mỗi đĩa trong mỗi lần rửa |
Hệ thống rửa bị nhiễm vi sinh vật | Làm sạch hệ thống với dung dịch rửa trước khi sử dụng |
Máy đọc bị trục trặc | Kiểm tra máy đọc |
Nhiệt độ phòng thí nghiệm quá cao hoặc quá thấp | + Duy trì nhiệt độ phòng từ 18 -250C. + Tránh thực hiện việc phân tích gần nguồn nhiệt hoặc trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời hoặc dưới lỗ thông hơi |
Cơ chất (Substrate) bị hỏng | Đảm bảo cơ chất không bị thay đổi màu sắc trước khi thêm vào các đĩa |
Chất phản ứng được trộn lẫn, bị nhiễm hoặc được chuẩn bị không đúng cách | Đảm bảo sử dụng đúng chất phản ứng, các dung dịch hoặc không xảy ra bất kỳ sự nhiễm nào |
Các giếng của đĩa bị nhiễm | + Tránh việc nhiễm chéo giữa các giếng bằng việc sử dụng tấm đậy phù hợp + Nếu sử dụng pipet đa kênh thì tránh không để chạm vào hóa chất trên đĩa |
4. Độ đọc OD thấp
Trong kỹ thuật ELISA, có một số nguyên nhân dẫn đến độ đọc OD thấp và sự lên màu của các giếng trong điã thấp. Mục này sẽ nêu lên một số hướng giải quyết cho phù hợp như sau:
Nguyên nhân | Cách khắc phục |
Nhiệt độ phòng thí nghiệm quá thấp | Duy trì nhiệt độ phòng từ 18 -250C. Tránh thực hiện việc phân tích dưới luồng t gió trực tiếp từ điều hòa |
Dung dịch rửa được pha chưa đúng tỷ lệ hoặc sử dụng sai dung dịch rửa | Khuyến cáo sử dụng dung dịch rửa pha theo đúng tỷ lệ đã cho trong bộ kit. Ghi nhãn cho từng dung dịch rửa để tránh sử dụng nhầm |
Hệ thống rửa nhiễm vi sinh vật | Làm sạch hệ thống rửa với dung dịch rửa trước khi sử dụng |
Sử dụng chu trình rửa nhiều hơn số lần được quy định | Đảm bảo về số lần rửa theo như khuyến cáo. Sử dụng số lần rửa tối thiểu theo như khuyến cáo cho thí nghiệm |
Không tuân thủ thời gian ủ, thời gian ủ quá ngắn | Cần tuân thủ thời gian ủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất bộ kit |
Các chất phản ứng và các đĩa ở nhiệt độ quá lạnh | Khi thực hiện phân tích, phải đảm bảo nhiệt độ của các đĩa và hóa chất ở nhiệt độ phòng bằng cách để các thành phần trên ra khỏi tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi bắt đầu thí nghiệm |
Sử dụng chất phản ứng hết hạn | Cần kiểm tra hạn sử dụng trước mỗi lần sử dụng |
Sử dụng không đúng chất cộng hợp (Conjugated) | + Mỗi chất cộng hợp là đặc hiệu cho mỗi bộ kit do đó cần phải sử dụng đúng loại + Không chuẩn bị các dung dịch quá xa thời điểm làm thí nghiệm + Nếu dung dịch cộng hợp không cần phải pha loãng thì phải lấy đủ dùng và sử dụng ngay. Không sử dụng lại phần thừa cho ngày hôm sau |
Đọc sai bước sóng khi phân tích | Xác định đúng bước sóng cho phân tích và đọc lại |
Các bộ kit bị chênh lệch điều kiện môi trường quá nhiều | + Kiểm tra nhật ký sử dụng xem bộ kit đã được sử dụng bao nhiêu lần + Kiểm tra xem bộ kit có bị để ở ngoài nhiệt độ bảo quản quá lâu hay không |
Các đĩa phân tích đã được sử dụng trước đó hoặc đã bị hư hỏng | + Các đĩa đã qua sử dụng phải được loại bỏ để tránh nhầm lẫn + Đảm bảo các đĩa trong tủ lạnh được đóng kín và có gói hút ẩm để duy trì điều kiện ổn định |
Không đủ lượng kháng nguyên trên bề mặt giếng | Sử dụng nhiều kháng nguyên hơn trong việc bao phủ bề mặt giếng |
Không đủ lượng kháng thể | Tối ưu nồng độ kháng thể cho phân tích |
5. Độ lặp lại kém
Một vấn đề thường gặp trong kỹ thuật ELISA là khả năng lập lại kém, khả năng lặp lại trong 1 đĩa 96 giếng hoặc khả năng lặp lại kém giữa các đĩa
Khả năng lặp lại kém trong 1 đĩa | |
Nguyên nhân | Cách khắc phục |
Thao tác thêm mẫu đối chứng và chất phản ứng vào đĩa phân tích mất quá nhiều thời gian | + Sử dung pipet đa kênh để thêm hóa chất vào nhiều đĩa cùng 1 lúc + Phân bố mẫu đối chứng và mẫu bệnh phẩm vào đĩa với thời gian như nhau |
Kháng thể không được phân chia đồng đều trong mẫu | + Nếu mẫu để trong tủ đông hoặc tủ lạnh, đảm bảo rằng nó được trộn đều trước khi pha loãng + Mẫu đã được pha loãng cũng cần phải được trộn đều trước khi nhỏ vào giếng |
Khả năng lặp lại kém giữa các đĩa | |
Nguyên nhân | Cách khắc phục |
Thời gian ủ không đồng nhất giữa các đĩa | Đảm bảo các đĩa có thời gian ủ như nhau |
Quy trình rửa khác nhau giữa các đĩa | Đảm bảo số lần rửa giống nhau giữa các đĩa |
Thao tác sử dụng pipet chưa tốt, pipet không được hiệu chuẩn định kỳ | Hiệu chuẩn pipet định kỳ để đảm bảo chính xác lượng mẫu cần dùng |
Các hóa chất sử dụng được lấy từ các bộ kit khác nhau | Nếu sử dụng hai bộ kit khác nhau cùng 1 lúc, hãy quan sát nhãn được dán trên mỗi loại hóa chất đảm bảo cho các hóa chất có cùng mã lot được sử dụng cho các đĩa tương ứng |
ThS. Đỗ Thị Phượng Linh
Tài liệu tham khảo:
http://www.elisa-antibody.com/
http://www.biomedia.vn
BẢN QUYỀN THUỘC VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG - TP. HỒ CHÍ MINH
Số 685 Trần Hưng Đạo - Phường 1 - Quận 5 - TP. Hồ Chí Minh | www.impehcm.org.vn
Điện thoại: 84-028-3923.7117 / 3923.9940 / 3923.7422 / 3923.8091 / 3923.9946 - Fax: 84-8-3923.6734
Giấy phép số 125/GP-BC (9/4/2007)