Chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng: Phương pháp tiếp cận sinh học phân tử

Giới thiệu

Các xét nghiệm dựa vào kính hiển vi và huyết thanh có nhiều giới hạn làm các nhà ký sinh trùng học hướng đến phương pháp khuếch đại gene được thực hiện bằng kỹ thuật PCR. Bên cạnh PCR truyền thống, bao gồm cả Nested và Multiplexed PCR, chúng ta đã thấy việc thực hiện Real-Time PCR (RT-PCR) để phát hiện một vài trường hợp nhiễm ký sinh trùng. Kỹ thuật mới hơn như kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt cấu trúc vòm và xét nghiệm dựa vào Luminex cũng đã nổi lên như là các hướng tiếp cận mới để chẩn đoán các bệnh ký sinh trùng.

Các phương pháp tiếp cận sinh học phân tử dựa trên acidnucleic biểu hiện độ đặc hiệu và độ nhạy tuyệt vời hơn các xét nghiệm chẩn đoán hiện có. Chúng cho phép phát hiện các mẫu nhiễm ký sinh trùng với mật độ rất thấp bao gồm các bệnh nhân không có triệu chứng. Ngoài ra, Multiplexed PCR cho phép phát hiện nhiều trình tự trong cùng một tube phản ứng cung cấp sự hữu ích trong chẩn đoán nhiễm một vài ký sinh trùng cùng lúc.

1. Real-Time PCR (RT-PCR)

RT-PCR không giống như PCR thông thường, cho phép định lượng nồng độ khuôn mẫu ban đầu thông qua việc dùng hóa chất phát huỳnh quang khác nhau, như Sybergreen, Taqman probes, huỳnh quang cộng hưởng truyền năng lượng (fluorescence resonance energy transfer) (FRET), và các mồi Scorpion. Nồng độ đo được thông qua việc so sánh với cuvet (curves) chuẩn. Điều này loại bỏ sự cần thiết trước mắt phải điện di trên gel, do đó giảm một cách đáng kể nguy cơ nhiễm và dương tính giả. Khi Multiplexed, RT-PCR cho phép xét nghiệm với độ chính xác cao (high-throughput) các trình tự khác nhau trong một tube phản ứng. Việc dùng Multiplexed RT-PCR, Shokoples và cộng sự có thể xác định bốn loài Plasmodium gây bệnh trên người (falciparum, vivax, malariae, and ovale) trong một tube phản ứng duy nhất thậm chí trong những mẫu mật độ ký sinh trùng rất thấp. Chạy Multiplex không chỉ giảm giá thành mỗi xét nghiệm mà còn cho phép thời gian xoay vòng nhanh, xét nghiệm chỉ mất 3 giờ để hoàn tất. Nó là một thuận lợi rõ ràng vượt qua kính hiển vi cái mà cần nguồn nhân lực và tốn thời gian xoay vòng chậm đặc biệt là nó mang đến độ chính xác cao (during high-throughput settings). Tương tự, Multiplexed RT-PCR đã chứng tỏ sự hữu dụng trong việc phân biệt các chủng sốt rét nhạy thuốc. Điều này quan trọng cho việc kê đơn thuốc sốt rét phù hợp.Trong ví dụ khác, Diez và cộng sự thì có thể phát hiện sự hiện diện của việc nhiễm T. cruzi trong trường hợp ghép tim bằng phương pháp PCR. Điều này cho phép điều trị trực tiếp bệnh nhân trước khi bệnh Chagas có thể tái hoạt. Những ví dụ này chứng tỏ rằng chẩn đoán hiệu quả và sớm có thể ảnh hưởng trực tiếp chăm sóc bệnh nhân và phương pháp tiếp cận dựa trên nền PCR có tiềm năng hỗ trợ việc đưa ra những lựa chọn đúng đắn để điều trị.

Mặc dù phương pháp dựa trên DNA thể hiện độ đặc hiệu và độ nhạy nổi trội, tiến tới thực hiện phương pháp này hằng ngày tại phòng thí nghiệm thì vẫn còn hạn chế áp dụng cho các vùng dịch tễ ở nông thôn. Thêm vào đó, như đã thấy với nhiều xét nghiệm huyết thanh thì phương pháp PCR cũng chưa ổn lắm bởi việc thiếu chuẩn cũng như việc tách chiết DNA, lựa chọn bộ primer, và chu trình khuếch đại khác nhau là tất cả các nhân tố mà có thể dẫn đến các biến đổi trong kết quả. Song thêm một bước tách chiết DNA tự động sẽ chắc chắn cải thiện xét nghiệm PCR để dùng trong chẩn đoán bệnh ký sinh trùng.

2. Khuếch đại đẳng nhiệt cấu trúc vòm (LAMP)

Khuếch đại đẳng nhiệt cấu trúc vòm (LAMP) là một phương pháp khuếch đại duy nhất với độ đặc hiệu và độ nhạy cực kỳ cao có thể để phân biệt trình tự khác nhau một nu. Nó đặc trưng bởi việc dùng 6 primer khác nhau được thiết kế chuyên biệt để nhận biết 8 vùng khác nhau trên gene mục tiêu, việc khuếch đại chỉ xảy ra nếu tất cả primer gắn kết vào khuôn và tạo thành sản phẩm. Trong quá khứ, LAMP đã là một ứng dụng thành công để phát hiện nhanh cả các virus mang DNA và RNA như virus West Nile và SARS. Gần đây, các nhà ký sinh trùng học đã quen với phương pháp LAMP để phát hiện một vài bệnh ký sinh trùng bao gồm các ký sinh trùng ở người Entamoeba, Trypanosoma , Taenia,Plasmodium, và Cryptosporidium, ký sinh trùng trên động vật Theilera và Babesia, và thậm chí xác định các vecto muỗi mang ký sinh trùng Plasmodium và Dirofilaria immitis. Hầu hết các nghiên cứu đã chỉ ra ánh hào quang với nhiều thuận lợi của phương pháp này hơn kỹ thuật PCR thông thường.

Không giống phản ứng PCR thường quy, LAMP được thực hiện tại điều kiện đẳng nhiệt (thường trong khoảng 60–65°C). Tính năng nổi bật này không chỉ mang lại lượng sản phẩm cao hơn, mà còn không cần phải mua thiết bị luân nhiệt và rút ngắn được thời gian phản ứng bằng cách loại bỏ thời gian luân nhiệt. Cộng thêm, phản ứng có thể thực hiện không cần tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm được thu thập như trong trường hợp của RIME, a nonautonomous retroelement (một yếu tố phía sau không tự chủ) tìm thấy trong Trypanosoma brucei rhodesiense và T. b. gambiense. Trong 35 phút, dùng thiết bị ủ nhiệt Water bath đơn giản, RIME LAMP có thể phát hiện 2 loài T. b. gambiense và T. b. rhodesiense trực tiếp từ mẫu máu, huyết thanh, và mẫu CSF. Quan trọng hơn, nghiên cứu này chỉ ra khả năng tái sản xuất (reproducibility) trong lĩnh vực này. Thêm vào các thuận lợi ở trên, phản ứng LAMP còndễ dàng thực hiện (set up), và kết quả dễđược đánh giá. Mẫu cần xét nghiệm được trộn với primers, chất nền, một DNA polymerase có khả năng dịch chuyển trên chuỗi trong một tube ly tâm. Trong suốt quá trình phản ứng một lượng lớn ion pyrophosphate được hình thành, dẫn đến việc hình thành kết tủa trắng. Độ đục này tương đương với lượng DNA được tổng hợp do đó có thể đánh giá một phản ứng bằng cách đo độ đục, hay đơn giản nhìn bằng mắt thường.

Với tất cả các lý do này, hứa hẹn trong tương lai sẽ áp dụng LAMP như một công cụ chẩn đoán nhiễm ký sinh trùng ở các vùng lưu hành nông thôn. Hơn nữa, khi nhiều nhóm ứng dụng LAMP trong lĩnh vực ký sinh trùng, chúng ta sẽ thấy sự xuất hiện của các xét nghiệm biến thể của LAMP đáp ứng nhu cầu phát hiện chính xác. Ví dụ, trong một nghiên cứu gần đây trên bò Babesia, một xét nghiêm Multiplex-LAMP (mLAMP) đã phát hiện đồng thời B. bovis và B. bigemina từ DNA tách chiết trong mẫu máu được thấm trên giấy thấm. Tương tự, Han và cộng sự đã thực hiện một xét nghiệm LAMP dựa trên gene 18S rRNA để phát hiện bốn loài Plasmodium (falciparum, vivax, malariae, and ovale). LAMP có độ nhạy tương đương và độ đặc hiệu tuyệt vời hơn nested PCR, việc mang lại kết quả tương đương nhưng tại một thời gian xoay vòng nhanh hơn. Kết quả của họ phù hợp với nhiều nghiên cứu khác chứng tỏ tính nhanh chóng, độ đặc hiệu và độ nhạy được cải thiện bằng cách dùng xét nghiệm LAMP.

3. Kỹ thuật Luminex xMAP

Kỹ thuật Luminex là đo dòng chảy tế bào trên nền hạt cho phép phát hiện nhiều mục tiêu khác nhau cùng lúc (http://www.luminexcorp.com/). Các vi hạt hình cầu có thể đồng gắn kết vào kháng nguyên, kháng thể, hay các oligonucleotides đóng vai trò như vật liệu dò (probes) trong xét nghiệm. Trên 100 vi hạt hình cầu thì sẵn sàng cho việc phát tín hiệu huỳnh quang riêng biệt khi bị kích thích bởi tia laser do đó cho phép xác định các mục tiêu khác nhau. Phỏng theo nghiên cứu về ký sinh trùng, xét nghiệm Luminex có thể xác định nhiều đối tượng hoặc genotypes khác nhau của sinh vật tham gia sử dụng cùng một phản ứng với thể tích rất nhỏ. Hướng tiếp cận này sẽ mang lại sự hữu ích trong nghiên cứu đa dạng kháng nguyên và các alleles kháng thuốc và để chẩn đoán bệnh ký sinh trùng.

Luminex được ứng dụng để nghiên cứu Cryptosporidium. Hai loài C. hominis và C. parvum không thể phân biệt được khi dùng các xét nghiệm kháng nguyên và huyết thanh. Chỉ phương pháp dựa trên sinh học phân tử đã thành công bằng cách khai thác sự khác nhau ở nu đơn lẻ trong vùng microsatellite-2 (ML-2) của 2 loài. Sử dụng trình tự DNA là công cụ chẩn đoán đáng được lựa chọn nhưng nó tốn kém, đòi hỏi nguồn nhân lực và tốn thời gian. Trong một nghiên cứu gần đây, Bandyopadhyay và cộng sự thành công trong việc phát hiện và phân biệt C. hominis và C. parvum trong 143 mẫu DNA tách chiết dùng kỹ thuật Luminex bằng cách dùng oligonucleotide probes cụ thể đối với vùng ML-2 của mỗi loài. Thời gian xoay vòng là 5 giờ để làm xét nghiệm này không chỉ nhanh hơn mà còn ít tốn kém hơn dùng PCR thông thườngsau đó phải giải trình tự. Nó mang đến độ chính xác 100% và nhạy hơn một xét nghiệm kháng thể huỳnh quang trực tiếp (DFA), một phương pháp thường quy dùng xác định các loài Cryptosporidium và Giardia. Chú ý rằng DFA không thể phân biệt C. hominis và C. parvum.

Tương tự các nghiên cứu khác, kỹ thuật Luminex có thể phát hiện mức độ ký sinh trùng trong tất cả các loại máu đối với bốn loài Plasmodium ở người (falciparum, vivax, malariae, and ovale) cùng một lúc. Nghiên cứu này chứng tỏ rằng kỹ thuật Luminex có thể cải thiện tốc độ, độ chính xác, và sự đáng tin cậy của các phương pháp PCR khác. Ví dụ, không cần phải điện di trên gel để phân biệt sự hiện diện của các sản phẩm LDR nhằm phát hiện 4 loài Plasmodium ở người.Thứ hai, tất cả các mẫu được xử lý cùng lúc và liên tụcthông qua một định dạng đĩa 96 giếng từ việc tách chiết DNA tất cả thông qua việc phân tích dữ liệu. Quá trình này được tự động và do đó có thể đạt được sự đồng nhất. Cuối cùng, sự chính xác cao (the high-throughput capability) của hệ thống Luminex cho thấy một sự thuận lợi rõ ràng hơn hẳn việc sử dụng kính hiển vi đòi hỏi nhiều lao động cho những nghiên cứu lớn.

ThS. Ngô Thị Hồng Phương
(lược dịch)

(Nguồn: Diagnosis of Parasitic Diseases: Old and New Approaches, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804041/)