Xây dựng phương pháp định lượng diethyltoluamid trong kem xua muỗi

Diethyltoluamid (N,N-diethyl-m-toluamid) được phát hiện vào đầu những năm 1940 và đến năm 1954 được chính thức đưa vào sử dụng rộng rãi làm hóa chất xua côn trùng trong cộng đồng.

Cho đến nay vẫn là sản phẩm tốt nhất, xua được phần lớn côn trùng và nói chung tác dụng lâu hơn các chất xua khác.

I – ĐẶT VẤN ĐỀ
Diethyltoluamid (N,N-diethyl-m-toluamid) được phát hiện vào đầu những năm 1940 và đến năm 1954 được chính thức đưa vào sử dụng rộng rãi làm hóa chất xua côn trùng trong cộng đồng. Cho đến nay vẫn là sản phẩm tốt nhất, xua được phần lớn côn trùng và nói chung tác dụng lâu hơn các chất xua khác. Để quản lý tốt chất lượng thuốc khi lưu hành trên thị trường, việc xây dựng phương pháp định lượng cho chế phẩm là hết sức cần thiết. Nhằm tìm ra phương pháp đơn giản với độ nhạy và chính xác cao chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng diethyltoluamid bằng HPLC.

II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu:
- Chất chuẩn đối chiếu: diethyltoluamid hàm lượng 102,9 % của hãng Merck (Đức) đạt tiêu chuẩn USP.
- Kem xua muỗi Toluamid chứa 15% diethyltoluamid. Các hóa chất dùng cho kiểm nghiệm, chạy sắc ký:
- Methanol và acid acetic dùng cho HPLC

2.2. Thiết bị nghiên cứu
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao hiệu Lachrom Merck Hitachi D7000, Detector UV-Vis

2.3. Phương pháp nghiên cứu [1], [2], [3].

2.3.1. Hoạt chất : N,N-diethyl-m-toluamid (diethyltoluamid)

Điều kiện sắc ký:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV-Vis
- Cột: Lichrosorb RP8, kích thước cột: 150 x 4,6 mm, kích thước hạt 10 µm
- iền cột RP8, kích thước cột: 10 x 4,6 mm, kích thước hạt 10 µm
- Bước sóng 265 nm.
- Pha động: methanol – dung dịch acid acetic 1 % (60: 40)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
- Thể tích một lần tiêm mẫu: 20 ml.
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng.
- Chuẩn bị mẫu thử:
- Dung dịch mẫu chuẩn diethyltoluamid:Dung dịch mẫu thử kem xua muỗi Toluamid:
- Cân chính xác khoảng80 mg diethyltoluamid cho vào bình định mức 100 ml.
- Thêm MeOH đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 mm, dung dịch có nồng độ khoảng 800 mg /ml. Hút chính xác 1 ml cho vào bình định mức10 ml. Thêm MeOH đến vạch, dung dịch có nồng độ khoảng 80 mg /ml.
- Cân chính xác khoảng0,5 g chế phẩm (tương đương với khoảng 75 mg diethyltoluamid cho vào bình định mức 100 ml. Thêm MeOH đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 mm, Hút chính xác 1 ml cho vào bình định mức 10 ml.
- Thêm MeOH đến vạch, dung dịch có nồng độ khoảng 75 mg /ml.
- ung dịch mẫu trắng (có thành phần tá dược giống mẫu kem thử nhưng không có diethyltoluamid): tiến hành pha như mẫu thử.

Khảo sát tính tương thích của hệ thống

Thực hiện 6 lần tiêm của mẫu chuẩn diethyltoluamid vào hệ thống sắc ký, khảo sát độ lặp lại của: thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (peak-area), hệ số bất đối xứng (As)

Thẩm định qui trình phân tích:

Tính đặc hiệu: chạy sắc ký đồ của mẫu trắng và mẫu thử.

Tính tuyến tính:
- Tiến hành ở dãy dung dịch chuẩn với 6 mức nồng độ: 50, 75, 100, 125, 150 và 175 mg /ml. Đo diện tích đỉnh trên máy HPLC theo phương pháp đã định.
- Từ diện tích đỉnh thu được, vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh, đánh giá tính tuyến tính.
- Độ lặp lại :
* Khảo sát trong cùng phòng thí nghiệm, cùng ngày, cùng phương pháp.
* Thực hiện 6 lần cân khác nhau trong cùng 1 mẫu thử kem xua muỗi. Mỗi lần với 3 lần tiêm mẫu, tính diện tích đỉnh trung bình. Từ kết quả thu được tính: độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD), giới hạn tin cậy (e), khoảng tin cậy (m).

Độ đúng:

* Tiến hành với thử nghiệm đơn, dùng 9 mẫu thử có nồng độ diethyltoluamid không đổi (đã xác định ở phần độ lặp lại), thêm vào chất chuẩn diethyltoluamid: 3 mẫu đầu thêm khoảng 80 %, 3 mẫu tiếp thêm khoảng 100 %, 3 mẫu còn lại thêm khoảng 120 % so với nồng độ đã có trong mẫu thử sao cho tổng nồng độ diethyltoluamid nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
* Tiến hành tiêm mỗi mẫu 3 lần vào hệ thống HPLC và đo diện tích đỉnh, tính giá trị trung bìnhTừ kết quả thu được sau mỗi lần đo, tính tỷ lệ phục hồi
III – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống

Thực hiện 6 lần tiêm của mẫu chuẩn diethyltoluamid vào hệ thống sắc ký
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tính tương thích của hệ thống

Kết luận: điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao cho độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích đỉnh, hệ số bất đối xứng. Hệ thống tương thích với qui trình địnhlượng.

IV - BÀN LUẬN

Phương pháp định lượng diethyltoluamid trong kem xua muỗi Toluamid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với pha động: methanol-acid acetic 1 % (60:40), bước sóng 265 nm đáp ứng tốt tính tương thích của hệ thống, kết quả các điều kiện định lượng phù hợp với phương pháp.

Qua thẩm định qui trình phân tích đã xác định được:
* Phương pháp có tính đặc hiệu cao, diethyltoluamid có 1 pic ở tR khoảng 5,2 phút, tách hoàn toàn riêng biệt với các píc của tá dược, điều này cho phép định lượng dựa vào diện tích đỉnh là phù hợp, xác định chính xác hàm lượng diethyltoluamid trong mẫu thử.
* Tính tuyến tính: nồng độ tuyến tính từ 50 – 175 mg/ml.
* Phương trình hồi qui: y = 34788x - 880624 với R2 = 0,995
* Độ lặp lại: phương pháp cho độ lặp lại tốt, RSD < 2 %.

Độ đúng: các kết quả thu được cho thấy tỷ lệ phục hồi đều nằm trong giới hạn cho phép (98-102 %).

V - KẾT LUẬN

* Phương pháp HPLC khảo sát đạt tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại.
* Từ các kết quả thu được, với phương pháp này có thể ứng dụng vào thực tế để định lượng diethyltoluamid trong chế phẩm kem xua muỗi mà hiện chưa có dược điển nào đề cập tới.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dược điển Việt nam, lần xuất bản thứ III, 2002
2. Nguyễn Minh Đức, Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu , kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, chi nhánh Nxb Y học, TP. Hồ Chí Minh, tr 139 – 171, 228 – 237, 2006
3.Võ Thị Bạch Huệ, Hóa phân tích, tập 2, Nxb Y học, Hà Nội, tr 106–119, 238–263,2008